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CGT技術(shù)基礎(chǔ)包括兩大核心技術(shù)，即基因編輯技術(shù)和基因遞送技術(shù)。
核心技術(shù)一一一基因編輯技術(shù)：基因編輯技術(shù)是一種能夠?qū)ι矬w基因組特定DNA序列進行精確修飾的技術(shù)，通過改變DNA序列來改變基因的功能，包括基因的表達、蛋白質(zhì)產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)等諸多方面?？梢岳没蚓庉嫾夹g(shù)修正致病基因，治療單基因遺傳病，如鐮狀細胞貧血、囊性纖維化等，通過基因編輯可以精準(zhǔn)地修復(fù)突變位點，恢復(fù)基因的正常功能。
1.ZFNs:1983年鋅指蛋白(Zinc finger protein，ZFP)首次在非洲爪蟾的轉(zhuǎn)錄因子IIA中被發(fā)現(xiàn)，第一種經(jīng)過改造的人工核酸內(nèi)切酶一一鋅指核酸酶(Zincfingernueleases，ZFN)在20世紀(jì)90年代末首次得到研究和應(yīng)用臨床轉(zhuǎn)化和開發(fā)一一第一代基因編輯技術(shù)ZFN技術(shù)發(fā)展于1996年，其目的基因特異性識別基于鋅指蛋白，DNA切割依賴于FOkI核酸內(nèi)切酶。每個鋅指蛋白可識別并結(jié)合一個特異的三聯(lián)體堿基，通過鋅指蛋白的排列，可實現(xiàn)對DNA序列的靶向性。但是ZFN的研發(fā)成本相對較高，合成較為困難，涉及到蛋白篩選體系，因此技術(shù)開發(fā)和臨床研究發(fā)展緩慢。
SangamoTherapeutics具有ZFN的數(shù)個關(guān)鍵專利，幾乎壟斷了ZFN技術(shù)的所有臨床轉(zhuǎn)化和開發(fā)。
2.TALEN：2007年植物黃單胞菌分泌的轉(zhuǎn)錄激活子樣被發(fā)現(xiàn)，同理構(gòu)建的轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物核酸酶(Transcription activator-like effector nucleases，TALENs)脫靶幾率小，細胞毒性小，成為另一種能夠高效簡便地靶向基因組的技術(shù)。TALEN技術(shù)發(fā)展于2011年，工作原理與ZFN基本類似，DNA切割同樣依賴于FOkI核酸內(nèi)切酶，但其目的基因特異性識別基于轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物，每兩個氨基酸組合對應(yīng)一個特定的堿基。TALEN的識別技術(shù)相比較于ZFN設(shè)計更加簡便，操作更加靈活，但其高昂的研發(fā)費用一定程度上阻止了其發(fā)展。
3．CRISPR/Cas9：突破性的第三代基因編輯技術(shù)2012年，基于細菌獲得性免疫系統(tǒng)的CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)出現(xiàn)并運用于哺乳動物中。CRISPR/Cas9的sgRNA可與基因組上特定序列結(jié)合，招募Cas9核酸內(nèi)切酶并產(chǎn)生DNA雙鏈斷裂。作為目前最熱門最強大的基因編輯系統(tǒng)，CRISPR/Cas9技術(shù)由于其簡單快捷的設(shè)計和構(gòu)建方法、低廉的成本和較低的脫靶效率，被迅速運用于各類疾病的細胞與基因治療中，為其帶來了革命性的突破，在臨床上極具應(yīng)用潛力。2016年，四川大學(xué)華西醫(yī)院為國際上首個開展CRISPR/Cas9臨床研究（NCT02793856）的機構(gòu)，利用基因編輯技術(shù)在T細胞中敲除PD-1基因治療非小細胞肺癌。2019年，EDIT-101被FDA批準(zhǔn)用于Leber先天性黑蒙癥10型的臨床治療研究中，這是第一個體內(nèi)開展的CRISPR/Cas9臨床試驗。目前為止，在ClinicalTrials有超過30個基于CRISPR/Cas9的細胞與基因治療臨床試驗注冊，其中絕大多數(shù)為針對腫瘤的臨床試驗，也有針對血液和眼部疾病的臨床試驗。中國是目前為止基于CRISPR/Cas9技術(shù)開展臨床試驗最多的國家。
4.新型CRISPR/Cas9技術(shù)：近幾年基因編輯技術(shù)不斷創(chuàng)新，更迭迅速，除了傳統(tǒng)的CRISPR/Cas9技術(shù)以外，一些新型的基于CRISPR/Cas9的基因編輯技術(shù)也逐步出現(xiàn)，包括CRISPRi，CRISPRa，堿基編輯器和引導(dǎo)編輯等。
核心技術(shù)二一一基因遞送：基因遞送技術(shù)是一類將外源基因（如治療性基因、標(biāo)記基因等）有效地運輸?shù)郊毎麅?nèi)部的技術(shù)，這是CGT應(yīng)用的關(guān)鍵步驟。載體主要包括病毒和非病毒載體，病毒載體遞送效率高、具有組織特異性、可插入宿主基因組，在藥物研發(fā)中被廣泛使用，約60%-70%的CGT臨床試驗使用病毒載體。非病毒載體操作簡單、成本小、免疫原性低，受到越來越多的關(guān)注，有望在將來替代病毒載體，降低細胞與基因治療藥物開發(fā)成本。
1.病毒載體介導(dǎo)的基因遞送
1）腺病毒載體（AdV)：腺病毒是一種無包膜的雙鏈DNA病毒，其基因組大小約為36kb。腺病毒載體通過對野生型腺病毒進行改造而得，去除了病毒的部分非必需基因，插入外源基因，同時降低病毒的致病性。
腺病毒主要通過與細胞表面的受體（如柯薩奇-腺病毒受體，CAR）結(jié)合，然后通過受體-介導(dǎo)的內(nèi)吞作用進入細胞。進入細胞后，病毒粒子在溶酶體中脫殼，釋放出病毒基因組，進入細胞核并進行基因表達。腺病毒載體不會整合到宿主細胞基因組中，因此基因的表達是暫時的，可能需要反復(fù)給藥來維持治療效果。
應(yīng)用領(lǐng)域：腺病毒載體在基因治療領(lǐng)域應(yīng)用廣泛，尤其是在腫瘤治療和疫苗開發(fā)方面。
2）腺相關(guān)病毒載體（AAV)：腺相關(guān)病毒是一種單鏈DNA病毒，基因組較小，約為4.7kb。
腺相關(guān)病毒載體是一種復(fù)制缺陷型病毒，需要腺病毒或皰疹病毒等輔助病毒才能復(fù)制，因此其安全性高；同時他能在多種細胞類型中實現(xiàn)長期穩(wěn)定的基因表達，免疫原性相對較低。
AAV通過與細胞表面的特定受體（如硫酸乙酰肝素蛋白聚糖等）結(jié)合，然后以內(nèi)吞的方式進入細胞。進入細胞后，單鏈DNA基因組進入細胞核，在宿主細胞的幫助下轉(zhuǎn)變?yōu)殡p鏈DNA，然后整合到宿主基因組（主要是在19號染色體的特定位置）或者以游離體的形式存在，從而實現(xiàn)基因表達。
應(yīng)用領(lǐng)域：AAV載體在基因治療領(lǐng)域，特別是對于一些遺傳性疾病的治療備受關(guān)注，主要用于眼部、大腦、肌肉和肝臟疾病的治療中。
3）慢病毒載體（LV)：慢病毒屬于逆轉(zhuǎn)錄病毒家族，是一種有包膜的RNA病毒。其基因組為單鏈RNA，通過逆轉(zhuǎn)錄過程可將RNA轉(zhuǎn)變?yōu)镈NA后整合到宿主細胞基因組中。慢病毒載體是在野生型慢病毒的基礎(chǔ)上改造而來，具有可以感染分裂和非分裂細胞的特性，能夠攜帶較大的外源基因片段，一般可達8-10kb。
慢病毒主要通過與細胞表面的受體（如CD4和CCR5或CXCR4等）結(jié)合，包膜與細胞膜融合，病毒核心進入細胞。在細胞內(nèi)，病毒RNA在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下轉(zhuǎn)化為DNA，然后在整合酶的幫助下整合到宿主細胞基因組中，從而實現(xiàn)長期的基因表達。
目前行業(yè)普遍使用的是第三代慢病毒載體一一四質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染系統(tǒng)，即由1個包含目的基因的表達質(zhì)粒GOI、2個包裝質(zhì)粒Rev和GagPol、1個包膜蛋白質(zhì)粒VSV-G等4個質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK293細胞，整個生產(chǎn)工藝分為上游工藝（upstreamprocessing，USP）和下游工藝（downstreamprocessing，DSP)。USP主要是細胞培養(yǎng)和病毒包裝，具體包括細胞復(fù)蘇和擴增、細胞培養(yǎng)、四質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染。DSP主要是去除病毒收獲液的雜質(zhì)，提高純度和滴度，保證載體的安全性和效率，具體包括收獲澄清、DNA去除、層析、TFF、除菌過濾和灌裝等環(huán)節(jié)。
應(yīng)用領(lǐng)域：慢病毒載體在基因治療和基因編輯領(lǐng)域應(yīng)用廣泛，可以將正常的造血干細胞基因遞送至患者體內(nèi)，重建正常的造血功能。
2.非病毒載體介導(dǎo)的基因遞送
1）脂質(zhì)體載體：脂質(zhì)體是一種人工合成的脂質(zhì)雙分子層囊泡，其內(nèi)部可以包裹水溶性的基因（如質(zhì)粒DNA）。脂質(zhì)體的組成成分主要是磷脂，通過調(diào)整磷脂的種類、比例和添加一些輔助成分（如膽固醇），可以改變脂質(zhì)體的性質(zhì)。脂質(zhì)體載體具有良好的生物相容性，相對安全，并且可以通過修飾表面基團來增加其靶向性。
脂質(zhì)體與細胞膜的融合是其主要的細胞進入方式。由于脂質(zhì)體和細胞膜都具有脂質(zhì)雙分子層結(jié)構(gòu)，它們可以在一定條件下融合，將包裹的基因釋放到細胞內(nèi)部。此外，脂質(zhì)體也可以通過內(nèi)吞作用進入細胞，然后在細胞內(nèi)的溶酶體中釋放基因。
應(yīng)用領(lǐng)域：脂質(zhì)體載體在基因治療和藥物遞送方面有廣泛的應(yīng)用，脂質(zhì)體可以包裹化療藥物和治療性基因，實現(xiàn)聯(lián)合治療，同時減少藥物對正常組織的副作用。
2）陽離子聚合物載體：陽離子聚合物是一類帶有正電荷的聚合物，如聚乙二胺（PEI)等。它們可以通過靜電相互作用與帶有負電荷的基因（如DNA或RNA）結(jié)合，形成穩(wěn)定的復(fù)合物。陽離子聚合物載體的優(yōu)點是可以攜帶較大的基因片段，并且可以通過修飾來改善其物理化學(xué)性質(zhì)和生物活性。
陽離子聚合物-基因復(fù)合物主要通過內(nèi)吞作用進入細胞。進入細胞后，復(fù)合物需要從內(nèi)吞泡中逃逸出來，以避免被溶酶體降解，然后將基因釋放到細胞質(zhì)或細胞核中。
應(yīng)用領(lǐng)域：在基因治療和基因編輯領(lǐng)域，陽離子聚合物載體可以用于遞送各種基因材料。
3）無機納米粒子載體：無機納米粒子（如金納米粒子、碳納米管、量子點等）可以作為基因遞送載體，具有良好的生物相容性和化學(xué)穩(wěn)定性，可以通過表面修飾（如連接陽離子聚合物或靶向分子）來實現(xiàn)基因的有效結(jié)合和靶向遞送。無機納米粒子載體進入細胞的方式多種多樣，包括內(nèi)吞作用、與細胞膜的直接相互作用等。應(yīng)用領(lǐng)域：可以利用納米粒子的靶向性將治療性基因遞送至腫瘤細胞，實現(xiàn)精準(zhǔn)治療，同時利用納米粒子的成像特性（如量子點的熒光特性）來監(jiān)測治療過程。